RESEARCH DESCRIPTION

Project Name: ความเป็นไปได้ของการรักษาผู้ป่วยมะเร็งเต้านมด้วยยา adriamycin และ epirubicin โดยใช้เซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MCF-7 ที่ตอบสนองต่อยา colchicine เป็นต้นแบบในหลอดทดลอง เพื่อศึกษาระดับการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1/พี-กลัยโคโปรตีน โดยวิธี western blot (Potential treatment of breast cancer patients with adriamycin and epirubicin using In vitro model MCF-7 human breast carcinoma cell line response to colchicine for the study of MDR1 gene/P-glycoprotein expression by western blot analysis)

Researcher:

Organization:Medicine/Biochemistry

Time:1 October 2006 - 30 September 2007

RESEARCHER

BUDGET

  1. BioMedical Engineering Center 200,000 Baht

ABSTRACT

โรคมะเร็งไม่เพียงแต่เป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญของประเทศทำให้เกิดการสูญเสียชีวิตของประชากรและสิ้นเปลืองค่าใช้จ่ายในการรักษาพยาบาลเป็นจำนวนมากเท่านั้น แต่โรคมะเร็งยังเป็นปัญหาสาธารณสุขของโลกด้วย การเจริญและการแพร่กระจาย (metastasis) ของโรคมะเร็งจนสุดท้ายทำให้เสียชีวิตนั้น เป็นผลมาจากเปลี่ยนแปลงที่สลับซับซ้อนในระดับโมเลกุลที่เกิดขึ้นในเซลล์มะเร็งเอง ซึ่งจนถึงบัดนี้ก็ยังไม่เป็นที่เข้าใจมากนัก แต่พบว่าการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะมีมากขึ้นเมื่อระยะของโรครุนแรงขึ้น ปัจจุบันนี้การใช้เคมีบำบัด (chemotherapy) มีบทบาทสำคัญมากในการรักษาโรคมะเร็งหลายชนิด โดยเฉพาะในปัจจุบันได้มีการพัฒนายาต้านมะเร็งให้มีประสิทธิภาพในการรักษาโรคมะเร็งได้ดียิ่งขึ้น เช่น Colchicine, Adriamycin และ Epirubicin โดย Colchicine มีฤทธิ์ยับยั้ง microtubule polymerization (Parness J, Horwitz SB, 1981), Adriamycin จะรบกวนวัฏจักรของเซลล์โดยยับยั้งการสร้างสารชีวโมเลกุล ไม่ให้มีการจับคู่ของดีเอ็นเอ และการส่งเสริมให้เซลล์มีโปรแกรมฆ่าตัวตาย (Apoptosis), ขณะที่ Epirubicin จะยับยั้งการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ และอาร์เอ็นเอ (Cancer Drug Manual 1994)
ปัญหาสำคัญที่ทำให้การรักษาด้วยเคมีบำบัดไม่ประสบความสำเร็จ และไม่มีประสิทธิภาพคือเซลล์มะเร็งเกิดการดื้อยา (drug resistance) หลังจากที่ได้รับยาต้านมะเร็งอย่างต่อเนื่องเป็นระยะเวลานาน ลักษณะที่สำคัญของเซลล์มะเร็งที่ดื้อยา คือ มีการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 (MDR1) โดยมีการสังเคราะห์โปรตีนเป้าหมายที่ชื่อว่า "พี-กลัยโคโปรตีน (p-glycoprotein)" ในระดับที่สูง ทั้งนี้พี-กลัยโคโปรตีนจะทำหน้าที่ในการขับยาออกจากเซลล์ทำให้มียาต้านมะเร็งสะสมในเซลล์น้อยลง ส่งผลให้เซลล์มะเร็งมีอัตราการมีชีวิตสูง ทั้งๆ ที่ได้รับยาต้านมะเร็ง ซึ่งสามารถพบได้ในเซลล์มะเร็งหลายๆ ชนิดด้วยกัน เช่น มะเร็งเต้านม มะเร็งปอด มะเร็งเม็ดเลือดขาว และมะเร็งปากมดลูกเป็นต้น
สำหรับมะเร็งเต้านม (Breast cancer cell) นั้นเป็นโรคที่สำคัญและพบมากเป็นอันดับที่ 2 ของมะเร็งในสตรีไทยรองจากมะเร็งปากมดลูก (ศุภกร และคณะ, 2542) ในอัตรา 16.9 คนต่อประชากรเพศหญิง 100,000 คน ในประชากรเพศหญิงของจังหวัดเชียงใหม่ซึ่งมีอุบัติการณ์ในการเกิดโรคสูงที่สุดในประเทศไทย (Vatanasapt et al., 2002) นอกจากนี้ยังพบว่ามะเร็งเต้านมเป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญต่อการเสียชีวิตของประชากรเพศหญิงในประเทศไทยอีกด้วย และมีแนวโน้มจะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ตามความเจริญในแบบประเทศอุตสาหกรรม โดยศุภกรและคณะ (2538, 2539) ได้รายงานว่าอัตราการเสียชีวิตของผู้ป่วยโนตมะเร็งเต้านมเพิ่มขึ้นจากเดิมในปี พ.ศ. 2538 คือ 474 รายต่อประชากร 100,000 คน เป็น 541 รายต่อประชากร 100,000 คน ในปี พ.ศ. 2539 โดยทั่วไปผู้ป่วยโรคมะเร็งเต้านมมักมาพบแพทย์เมื่อพบก้อนเนื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 2 ซม. (เซนติเมตร) ซึ่งระยะนี้เริ่มมีการกระจายของเซลล์มะเร็งไปยังส่วนต่างๆ ทั่วร่างกาย และเป็นสาเหตุทำให้ผู้ป่วยเสียชีวิต การตรวจของแพทย์ทำโดยการซักประวัติ ตรวจร่างกายด้วยการคลำก้อนเนื้อบริเวณเต้านม หากพบว่าก้อนเนื้อแข็ง ผิวขรุขระ หรือสงสัยว่าเป็นมะเร็ง แพทย์จะขอให้ผู้ป่วยไปรับการตรวจด้วยวิธีการใช้เข็มดูดเจาะ (Fine needle aspiration, FNA) ก้อนที่เต้านมเพื่อตรวจหาเซลล์มะเร็ง หากไม่สามารถยืนยันผลว่าผู้ป่วยเป็นมะเร็ง แพทย์ก็จะขอให้ผู้ป่วยรับการตรวจโดยวิธีผ่าตัดก้อนเนื้อที่เต้านมไปตรวจทางพยาธิวิทยา (biospy) (Amuntakul et al., 1985; ศุภกร และคณะ, 2542) มะเร็งเต้านมแบ่งตามพยาธิสภาพได้ 5 ชนิด คือ infiltrating ductal carcinoma, adenocarcinoma, lobular carcinoma, medullary carcinoma และชนิดที่ไม่สามารถระบุชนิดของเซลล์มะเร็งได้ (Bunyaratavei, 1999) การจัดระดับความรุนแรงของโรคมะเร็งเต้านมประเมินได้จากขนาดของก้อนเนื้อที่คลำได้ (Tumor, T) ต่อมน้ำเหลืองรักแร้ที่คลำได้ (Node, N) การแพร่กระจายของมะเร็ง (Metastasis, M) ซึ่งวิธีการนี้เรียกว่า ระบบ TNM (American Joint Committee on Cancer, 1997) โดยในระบบ TNM นี้ได้แบ่งระดับความรุนแรงไว้ที่ 5 ระดับ คือระยะ 0 เป็นระยะที่คลำไม่พบก้อน ตรวจพบโดยการส่งชิ้นเนื้อเพื่อตรวจหาเซลล์มะเร็ง ระยะที่ 1 มีขนาดของก้อนเนื้อเส้นผ่าศูนย์กลางน้อยกว่า 2 ซม. ระยะที่ 2 เนื้องอกมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 2-5 ซม. และเซลล์มะเร็งกระจายไปยังต่อมน้ำเหลืองที่รักแร้ข้างเดียวกับก้อนเนื้องอก ระยะที่ 3 เนื้องอกมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางมากกว่า 5 ซม.ขึ้นไป และมีต่อมน้ำเหลืองโต ระยะที่ 4 มะเร็งกระจายไปที่ต่อมน้ำเหลืองเหนือกระดูกไหปลาร้าข้างเดียวกับตำแหน่งที่เป็นมะเร็งเต้านม หรือมะเร็งกระจายไปที่ตับ ปอด และกระดูก  มะเร็งเต้านมระยะที่ 2 และ 3 พบมากถึงร้อยละ 80 (Bunyaratavei, 1999) สาเหตุของการเกิดมะเร็งเต้านมยังไม่ทราบแน่ชัด แต่มีปัจจัยเสี่ยงที่เกี่ยวข้องหลายอย่าง เช่น คนในครอบครัวเคยป่วยเป็นโรคมะเร็งเต้านมมาก่อน สตรีที่มีน้ำหนักตัวมากกว่าปกติมีโอกาสที่จะเป็นมะเร็งเต้านมได้มาก สตรีเชื้อชาติอเมริกันหรือยุโรปมีโอกาสเป็นมะเร็งเต้านมมากกว่าสตรีทางเอเชีย และสตรีที่มีประจำเดือนครั้งแรกเมื่ออายุน้อยหรือหมดประจำเดือนเมื่ออายุมากจะมีโอกาสเป็นมะเร็งเต้านมมากกว่าสตรีที่มีระยะของการมีประจำเดือนสั้น (ศุภกร และคณะ, 2542; สมปอง, 2529)
การรักษามะเร็งเต้านมมี 4 วิธีได้แก่ การผ่าตัด เคมีบำบัด ฮอร์โมน และรังสีรักษา การผ่าตัดที่นิยมมี 2 วิธี วิธีแรกคือการตัดก้อนมะเร็งพร้อมเต้านม และเลาะต่อมน้ำเหลืองรักแร้ข้างเดียวกันออกให้หมด (Modified radical mastectomy, MRM) (สมปอง, 2529) วิธีที่ 2 คือ การตัดก้อนมะเร็งออกโดยพยายามรักษาเต้านมไว้ (Conservative breast surgery) (สมปอง, 2529; Kirby et al., 1999) การให้เคมีบำบัดซึ่งเป็นสารเคมีที่มีคุณสมบัติทำลายเซลล์มะเร็งที่แพร่กระจายไปยังต่อมน้ำเหลืองและอวัยวะอื่นๆ (Micrometastasis) เป็นยาที่ให้โดยวิธีฉีดและรับประทาน ที่นิยมให้คือ cyclophosphamide, methotrexate และ 5-fluorouracil (CMF) โดยจะให้รับประทาน cyclophosphamide ขนาด 100 มิลลิกรัมต่อตารางเมตรของพื้นที่ผิวร่างกายต่อวัน เป็นระยะเวลา 14 วัน ขณะที่จะให้ methotrexate และ 5-fluorouracil โดยฉีดเข้าเส้นเลือดดำในวันที่ 1 และ 8 ของแต่ละเดือน อัตราขนาด 40 และ 500 มิลลิกรัม ต่อตารางเมตรของพื้นที่ผิวร่างกาย ตามลำดับ โดยแต่ละรอบจะพักการให้ยา 14 วัน รวมเป็นรอบละ 28 วัน  และจะให้การรักษาด้วยยาดังกล่าวแก่ผู้ป่วยเป็นระยะเวลาอย่างน้อย 6 รอบ หรือประมาณ 6 เดือนติดต่อกัน นอกจากนั้นยังมีการใช้ยาเคมีบำบัดชนิด Adriamycin และ Epirubicin ในรูปของการรักษาแบบ CAF ซึ่งประกอบด้วยยาชนิด cyclophosphamide, Adriamycin (Doxorubicin Hydrochloride) และ 5-fluorouracil  และการรักษาแบบ CEF ซึ่งประกอบด้วยยาชนิด Cyclophosphamide, Epirubicin  และ 5-fluorouracil (5-FU) ตามลำดับ โดยแพทย์จะใช้การรักษาแบบใดนั้นขึ้นอยู่กันสภาพของผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษา
ในกรณีที่ผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาเป็นมะเร็งเต้านมระยะที่ 3 ขึ้นไป หรือต้องการให้เคมีบำบัดเพื่อลดขนาดของก้อนมะเร็งก่อนการผ่าตัดหรือรังสีรักษา (Neoadjuvant chemotherapy) หรือเมื่อให้การรักษาแก่ผู้ป่วยแบบ CMF แล้วไม่ได้ผล โดยพิจารณาจากผู้ป่วยที่ได้รับผ่าตัดแล้วเป็นซ้ำภายใน 2 ปี หรือผู้ป่วยที่ไม่ได้รับการผ่าตัดแต่เป็นซ้ำภายใน 2 ปี โดยแพทย์จะทำการรักษาแบบ CAF ด้วยการให้ Cyclophosphamide, Adriamycin และ 5-fluorouracil โดยฉีดเข้าเส้นเลือดดำทุก ๆ 21 วันในวันที่ 1 ของแต่ละรอบ อัตราขนาด 500, 50 และ 500 มิลลิกรัมต่อตารางเมตรของพื้นที่ผิวร่างกายตามลำดับ และจะให้การรักษาด้วยยาดังกล่าวแก่ผู้ป่วยเป็นระยะเวลาอย่างน้อย 4 - 6 รอบติดต่อกัน (Bonneterre, Roche, Kerbrat , et al., 2004; The French Adjuvant Study Group, 2001)
เนื่องจาก Adriamycin เป็นยากลุ่ม Anthracycline ที่เป็นพิษต่อหัวใจ (Cardiotoxicity) ซึ่งมีลักษณะอาการที่พบ ได้แก่ การเต้นของหัวใจไม่เป็นจังหวะ(dysrhythmia), การหายใจเร็วมาก (tachypnea), หัวใจขยาย(cardiac dilatation), ปอดบวมน้ำ (pulmonary edema) และ ภาวะช็อกทีมีสาเหตุจากหัวใจสูบฉีดเลือดน้อย (cardiogenic shock) เป็นต้น ระดับของยาสะสม (Total cumulative dose) ที่ให้ของ Adriamycin ต้องไม่เกิน 450 - 500 มิลลิกรัมต่อตารางเมตร ขณะที่ Epirubicin ซึ่งเป็นยากลุ่ม Anthracycline เช่นเดียวกับ Adriamycin ที่เป็นพิษต่อหัวใจ (Cardiotoxicity)  แต่มีความเป็นพิษต่อหัวใจที่น้อยกว่า Adriamycin (Launchbury, Habboubi, 1993; Torri, Bristow, Lum BL et al., 1986) โดยระดับของยาสะสม (Total cumulative dose) ที่ให้ของ Epirubicin ต้องไม่เกิน 1,000 มิลลิกรัมต่อตารางเมตร ในปัจจุบันแพทย์จึงนิยมใช้ Epirubicin แทน Adriamycin ด้วยเหตุผล 2 ประการคือ ความเป็นพิษต่อหัวใจของ Epirubicin ที่น้อยกว่า Adriamycin เมื่อพิจารณาระดับของยาที่ให้เท่ากัน และระดับของยาสะสม (Total cumulative dose) ที่ให้ของ Epirubicin สามารถมีระดับที่มากกว่า Adriamycin (Von Hoff, Layard, Basa, et al., 1979; Bonadonna, Gianni, Santoro, et al., 1993)
การรักษาด้วยฮอร์โมนที่นิยมให้คือ anti-estrogen คือยา tamoxifen รับประทานวันละ 20 มิลลิกรัม เป็นระยะเวลา 5 ปี สำหรับการฉายรังสีซึ่งเป็นวิธีสุดท้ายนั้นจะให้ในผู้ป่วยที่รับการผ่าตัด MRM ไปแล้วและเมื่อขนาดมะเร็งเส้นผ่าศูนย์กลางมากกว่า 5 ซม. หรือเซลล์มะเร็งกระจายมาที่ต่อมน้ำเหลืองรักแร้ข้างเดียวกันเกิน 4 ต่อม โดยให้รังสี electron beam หรือ photon beam ที่ตำแหน่งต่อมน้ำเหลืองใต้กระดูก (Internal mammary node) จะให้ 3,250 - 4,500 rad แบ่งให้วันละ 200 rad ส่วนผู้ป่วยที่ผ่าตัดด้วยวิธี conservative breast surgery จะให้รังสี 4,600 - 5,000 rad ที่บริเวณทรวงอกและรักแร้ ส่วนบริเวณแผลผ่าตัดจะฉายรังสีเพิ่มอีก 1,000 - 2,000 rad (Michael and Nancy, 1998; Barbara, et al., 1998)
การรักษาโรคมะเร็งเต้านมระยะที่ 1 ใช้วิธีผ่าตัดแบบ MRM หรือ Conservative breast surgery หลังจากนั้นจะให้รังสีรักษาร่วมด้วย มะเร็งเต้านมระยะที่ 2 และ 3 ใช้วิธีผ่าตัดร่วมกับเคมีบำบัด หลังให้เคมีบำบัดครบแล้วจะให้ยา tamoxifen สำหรับผู้ป่วยโรคมะเร็งเต้านมระยะที่ 4 ให้เคมีบำบัดร่วมกับรังสีรักษา และยา tamoxifen หากก้อนมะเร็งมีขนาดเล็กลงครึ่งหนึ่งของก้อน จะทำการผ่าตัด (American Joint Committee on Cancer, 1997)
จากการศึกษาพบว่ามีผู้ป่วยที่เกิดภาวะดื้อยารักษามะเร็งเต้านมเกิดขึ้นด้วยเนื่องจากว่ามีการรักษาด้วยเคมีบำบัดเป็นระยะเวลาที่ยาวนานต่อเนื่องกัน ดังนั้นงานวิจัยเกี่ยวกับการหาวิธีที่จะลดภาวะดื้อยาของผู้ป่วยโรคมะเร็งเต้านมที่ดื้อยาเคมีบำบัด จึงเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งต่อวงการแพทย์ในปัจจุบัน จากรายงานของผู้ป่วยมะเร็งเม็ดเลือดขาว (leukemia) ที่ได้รับเคมีบำบัด พบว่าเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 โดยมีเปอร์เซ็นต์ของการแสดงออกตั้งแต่ 19  - 75% ของผู้ป่วยที่ไม่ได้ทำเคมีบำบัด (Sonneveld, 1996)  ดังนั้นทำให้ทราบว่าผู้ป่วยแต่ละคนจะมีการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 ที่แตกต่างกันและทำให้มีผลต่อการรักษาด้วยเคมีบำบัดที่น่าที่จะแตกต่างกันออกไปด้วย โดยอาจสรุปได้ว่าการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 สามารถบอกถึงอุบัติการณ์ของการเกิดการดื้อยาในผู้ป่วยได้ นอกจากนี้ยังมีรายงานการศึกษาอุบัติการณ์ของการแสดงออกของพี-กลัยโคโปรตีนกับการเกิดการดื้อยาของผู้ป่วยที่เป็น soft tissue sarcoma (STS) ซึ่งทำการศึกษาโดย immunocytochemistry และ immunohistochemistry พบว่ามีการแสดงออกของ พี-กลัยโคโปรตีน ที่ 62% และ 58% ตามลำดับ (Coley et al., 2000) เช่นกัน
สำหรับรายงานเกี่ยวกับการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 ในผู้ป่วยมะเร็งเต้านมที่ได้รับเคมีบำบัด พบว่ามีการแสดงออกประมาณ 30 - 40% ของผู้ป่วยมะเร็งเต้านมชนิด Primary Breast cancer และ 50% ของผู้ป่วยมะเร็งเต้านมชนิด Metastatic Breast cancer (Ihnat, 1999; Hirano, Onda, Toma, Miyaoka, Moriyasu, and Oka, 2004)
ปัจจุบันยังไม่มีรายงานที่เกี่ยวกับอุบัติการณ์การแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1 และพี-กลัยโคโปรตีนกับภาวะการดื้อยาของผู้ป่วยมะเร็งเต้านมจากโรงพยาบาลมหาราชนครเชียงใหม่ของประเทศไทยที่ได้รับยาเคมีบำบัดชนิด Adriamycin และ Epirubicin ดังนั้นการศึกษาเบื้องต้นควรจะเป็นการศึกษาในหลอดทดลอง (In vitro) โดยใช้เซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MFC-7 breast carcinoma cell line ชนิดดื้อยา (MFC-7/MDR) ที่มีเซลล์มะเร็งชนิดไวต่อยา (MFC-7/WT) เป็นเซลล์ควบคุม เป็นการทดลองต้นแบบ เซลล์มะเร็งเต้านมนี้ได้รับความอนุเคราะห์มาจาก Prof. Dr. Michael M. Gottesman (National Cancer Institute, Bethesda, USA) และ รศ.ดร. พรงาม ลิ้มตระกูล ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ โดยเซลล์มะเร็งเต้านมชนิดดื้อยานี้จะได้รับการกระตุ้นด้วย Colchicine ในระดับความเข้มข้น 60 ng/ml
ผู้วิจัยมีความสนใจเป็นอย่างมากต่อศึกษาความเป็นไปได้ของการรักษาผู้ป่วยมะเร็งเต้านมด้วยยา Adriamycin หรือ Epirubicin โดยใช้เซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MCF-7 ที่ตอบสนองต่อยา Colchicines เป็นต้นแบบในหลอดทดลอง เพื่อศึกษาระดับการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1/พี-กลัยโคโปรตีน โดยวิธี Western blot โดยเปลี่ยนชนิดของยาจาก Colchicine เป็น Adriamycin และ/หรือ Epirubicin ในระดับความเข้มข้นมากกว่าหรือเท่ากับ 60 ng/ml ว่าจะมีผลต่อการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1/พี-กลัยโคโปรตีนในเซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MFC-7 breast carcinoma cell line ชนิดดื้อยา (MFC-7/MDR) เป็นอย่างไร โดยใช้เซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MFC-7 breast carcinoma cell line ชนิดไวต่อยา (MFC-7/WT) เป็นเซลล์ควบคุม ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้จึงเป็นการศึกษาถึงความเป็นไปได้ของการรักษาผู้ป่วยมะเร็งเต้านมด้วยยา Adriamycin หรือ Epirubicin โดยใช้เซลล์มะเร็งเต้านมชนิด MCF-7 ชนิดดื้อยา  (MFC-7/MDR) ที่ตอบสนองต่อยา Colchicines เป็นต้นแบบในหลอดทดลอง เพื่อศึกษาระดับการแสดงออกของยีนเอ็มดีอาร์1/พี-กลัยโคโปรตีน โดยวิธี Western blot โดยมีเซลล์มะเร็งชนิดไวต่อยา (MFC-7/WT) เป็นเซลล์ควบคุม ทั้งนี้ผู้วิจัยยังจัดทำระบบการทำงานของห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้องกับวิธี Western blot ให้เข้าข่ายมาตรฐานสากลของระบบ ISO/IEC Guide 17025 (สำนักงานมาตรฐานผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม, 2548) เพื่อรองรับการตรวจสอบและประเมินเบื้องต้นได้ ในการเตรียมตัวเป็นมหาวิทยาลัยแห่งการวิจัยต่อไป ข้อมูลที่ได้จากการทดลองทั้งหมดนำไปวิเคราะห์และประเมินผลทางสถิติ หาความแตกต่างทางสถิติ โดยวิธี Student's t-test ที่ระดับความเชื่อมั่น 95% (P < 0.5).