RESEARCH DESCRIPTION

Project Name: การหาสภาวะที่เหมาะสมโดยวิธีซิมเพลกในการผลิต single chain แอนติบอดีต่อโปรตีน p17 ของเชื้อ HIV-1 ที่สร้างจากเชื้อ Escherichia coli ในถังหมักปริมาตร 5 ลิตร (Sequential simplex optimization of recombinant single chain antibody of HIV-1 p17 protein production by Escherichia coli in 5 liter bioreactor)

Researcher: Bordin Butr-Indr

Organization:Associated Medical Sciences/Medical Technology

Time:1 October 2009 - 30 September 2010

RESEARCHER

  1. Bordin Butr-Indr (Head of project)

BUDGET

  1. BioMedical Engineering Center 100,000 Baht

ABSTRACT

HIV-1แมททริกโปรตีน P17 เป็นโปรตีนโครงสร้างซึ่งมีความสำคัญในวงจรการเพิ่มจำนวนของ ไวรัส HIV-1 โปรตีนจะมีความสำคัญในการเพิ่มจำนวนของไวรัสในนิวเคลียส ของเซลล์ พบว่า P17 โปรตีนมีส่วนเกี่ยวข้องกับการจับตัวกันของ RNA ไวรัส และการส่ง RNA ไปยังผิวด้านบนของพลาสม่า ซึ่งมีส่วนร่วมกันกับเปลือกของไวรัส HIV-1 และกระบวนการต่างๆในการรวมตัวกันขององค์ประกอบ ของไวรัส ก่อนทีจะแพร่กระจายออกนอกเซลล์ การพัฒนาการผลิตวัคซีนต่อต้านไวรัส HIV เป็นความหวัง ในการลดการแพร่กระจายของเชื้อ HIV แอนติบอดี ต่อโปรตีน P17 สามารถที่จะหยุดกระบวนการ เพิ่มจำนวนไวรัส HIV และการแพร่กระจายออกนอกเซลล์ของตัวเชื้อได้ การผลิดแอนติบอดีวัคซีนจึงมี ความสำคัญ ทั้งในแง่ของการรักษา การผลิตชุดตรวจ และงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง การผลิตโปรตีน P17 แอนติบอดีจากแบคทีเรีย ซึ่งพัฒนาโดยเทคนิคพันธุวิศวกรรมจึงมีความสำคัญมาก แต่การศึกษาที่ผ่านมา พบว่าโปรตีนที่ผลิตได้มีความไม่เหมาะสมและนำไปใช้งานได้น้อย การพัฒนาวิธีการหาสภาวะที่เหมาะสม ในการผลิตโปรตีนโคลน  โดยทฤษฎี sequential simplex optimization เพื่อมาใช้ในการหาสภาวะ ที่เหมาะสมในการผลิตจึงมีความสำคัญ ในการศึกษาครั้งนี้มีตัวแปรถึงหกตัวแปรซึ่งมีผลต่อการผลิตโปรตีน โคลนประกอบด้วย ความเข้มข้นของแหล่งคาร์บอน ปริมาณเซลล์ที่ใช้ในการผลิต ความเข้มข้นของ สารกระตุ้นการสร้างโปรตีน ความเป็นกรดด่าง อุณหภูมิ และอัตราการกวน จากการศึกษาพบว่าสภาวะ ที่เหมาะสมที่ได้จากการทดลองโดยวิธี Sequential simplex optimization คือ ระยะเวลาการเลี้ยงหลังการ กระตุ้นให้สร้างโปรตีน 16.5 ชั่วโมง ความเข้มข้นของ IPTG ที่ใช้กระตุ้น 0.05 mM อุณหภูมิที่ใช้ หลังการกระตุ้น 25.5 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของเซลล์ที่ใช้ในการกระตุ้น 1.68 ที่ความยาวคลื่น 600  นาโนเมตร อัตราการกวน  202 รอบต่อนาที จากผลการศึกษาในครั้งนี้พบว่าความหนาแน่นสุดท้ายของ เซลล์ เพิ่มขึ้น 10% และอัตราการผลิต เพิ่มสูงขึ้น 29.7% เมื่อเทียบกับสภาวะเริ่มต้นที่ยังไม่ได้ทำการทดลอง การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของวิธี Sequential simplex optimization เพื่อใช้ในการ ผลิตโปรตีนนอกเซลล์

The HIV-1 matrix protein p17 is a structural protein that is essential in the life cycle of the retrovirus. In the early stages of virus replication, p17 participates in the pre-integration of the DNA complex into the nucleus. More specifically, p17 is involved in viral RNA binding and transport to the plasma membrane, in the incorporation of the HIV-1 envelop into virions and in the assemblage of the viral particles. The development and production of a vaccine against HIV/AIDS represents the only realistic hope to contain the spread of HIV infection. Antibody to p17 epitopes is able to inhibit HIV replication and spreading. Production of antibody is important for vaccine, detection kit and research development. Recombinant single chain antibody expression system is advantages but prokaryotic systems are a problem as most proteins become insoluble in inclusion bodies and are very difficult to recover as functional proteins.

The sequential simplex method is a useful tool for rapidly optimizing a process by moving through factor space via a relatively simple geometric algorithm. This method will be employed to optimize growth and extracellular single chain anti HIV-1 p17 protein (scFv-p17) production in Escherichia coli HB2151. Six experimental parameters are investigated: concentration of carbon source, cell and IPTG, pH, temperature, and agitation rate. Optimized conditions were as follows: cultivation time for 16.5 hour with 0.05 mM IPTG concentration, at a temperature of 25.5°C, optical density for induction of 1.68 and agitation rate of 202 rpm. The results for cell density and extracellular scFv-P17 production were, 10% and 29.7% higher than in non optimized condition. The present work demonstrates the effectiveness of the sequential simplex optimization method in obtaining high yields of extracellular recombinant protein production.